弊社取り扱いメーカーのウエスタンブロット(Western Blot)プロトコル／トラブルシューティングガイドをご紹介します。ウエスタンブロット(Western Blot)実験のご参考にして下さい。
| バンドが検出されない |
| 考えられる原因 |
アドバイス |
| 使用抗体に問題がある |
抗体が目的タンパク質に対してアフィニティが低い可能性があります。抗体の希釈濃度を2～4倍に上げてみてください。 |
| 抗体が失活している可能性があります。ドットブロットを行い，確認してみてください。 |
| 目的タンパク質の量に問題がある |
ゲルに泳動する総タンパク質量を増やしてみてください。 |
| ウェスタンブロッティング以外の手法で，目的タンパク質に試料中に存在することを確認して下さい。 |
| 目的タンパク質の組換え体タンパク質や目的タンパク質を発現している細胞ライセートを，ポジティブコントロールとして使用して下さい。 |
| トランスファーが不十分である |
PVDF/Immobilon-Pメンブレンをメタノールで十分湿らせて下さい。ニトロセルロースメンブレンをトランスファーバッファーで十分湿らせて下さい。 |
| PVDFメンブレンとゲルがしっかりと密着するようにして下さい。 |
| トランスファーが完了していない |
トランスファーする時間を調整して下さい。高い分子量のタンパク質の場合は，長時間のトランスファーが必要な場合があります。 |
| トランスファーが完了したことを，メンブレンのPonceau S染色などで確認して下さい。 |
| プレステインマーカーを泳動して，トランスファーができたことを視認して下さい。 |
| トランスファー過剰である |
低分子量のタンパク質（＜10 kDa）をトランスファーする場合は，電圧もしくはトランスファー時間を減らしてみて下さい。 |
| 等電が＞9である |
使用バッファーを高pHのバッファーに変えてみて下さい（pH10.5のCAPSなど）。 |
| 交差性が異なる二次抗体を使用している |
一次抗体のイムノグロブリンのタイプと，免疫動物種を確認し，適切な二次抗体を使用して下さい。 |
| 抗体が古い |
抗体が使用期間を過ぎていた場合は，新しい抗体を使用して下さい。 |
| 抗体の保存方法を誤っている |
メーカー推奨の保存条件の通りに保存し，凍結融解の回数を最小限にしてください。 |
| アジ化ナトリウムのコンタミネーション |
各バッファーにアジ化ナトリウムが混入していないことを確認して下さい。 |
| 一次抗体とメンブレンのインキュベーション時間が短い |
インキュベーション時間を４℃でオーバーナイトにしてみて下さい。 |
| バンドが薄い（シグナルが弱い） |
| 考えられる原因 |
アドバイス |
| 目的タンパク質－抗体間の結合が弱い |
メンブレンの洗浄回数を減らしてみて下さい。 |
| 洗浄バッファー中のNaCl濃度を減らしてみて下さい（0.15～0.5M)。 |
| 抗体の希釈液中のNaCl濃度を減らしてみて下さい（0.15～0.5M）。 |
| 使用抗体に問題がある |
使用抗体の目的タンパク質に対するアフィニティが低い。抗体濃度を2～4倍に上げてみて下さい。 |
| タンパク室質量が不十分である |
ゲルに泳動する総タンパク質量を増やしてみてください。 |
| 酵素-基質複合体の形成が不十分である |
酵素と基質をチューブで混合して下さい。もし発色しない場合は，混合が不十分です。 |
| ECLが弱い，ECLが古い |
新しいECLを使用して下さい。 |
| スキムミルクによって目的タンパク質のバンドがマスクされている |
ブロッキングバッファーや抗体希釈液中のミルク濃度をい下げるか，3％BSAに置き換えてみて下さい。 |
| バンドが過剰に出ている |
| 考えられる原因 |
アドバイス |
| 一次抗体が非特的結合を起こしている |
一次抗体の希釈濃度を低くしてみて下さい。 |
| ゲルに泳動させるタンパク質量を減らしてみて下さい。 |
| モノクローナル抗体やアフィニティ精製された抗体を使用して下さい。 |
| 二次抗体が非特異的結合を起こしている |
二次抗体とコントロールを混合した試料を，ゲルに泳動して下さい。もしバンドが出てしまった場合は，違う二次抗体を使用して下さい。 |
| モノクローナル抗体やアフィニティ精製された抗体を使用して下さい。 |
| 一次抗体または二次抗体が非特的結合を起こしている |
0.1～0.5％ Tween 20を，一次抗体もしくは二次抗体に添加して下さい。 |
| ブロッティングバッファー中に2％スキムミルクを使用し，抗体の希釈液として使用して下さい。シグナルの出方に応じて，濃度を上下に調節して下さい。 |
| 洗浄回数を増やしてみて下さい。 |
| 抗体希釈液および洗浄バッファー中のNaCl濃度を，減らしてみて下さい（0.15～0.5M）。 |
| メンブレンの洗浄バッファー中のTween 20濃度を上げてみてください（0.1～0.5％）。 |
| 試料のタンパク質がアグリゲーションしている |
DTT量を増やして（20～100 mM DTT），タンパク質のジスルフィド結合を完全に還元して下さい。また，十分にボイルして下さい（5～10分）。 |
| 試料を遠心し，凝集物を泳動しないようにして下さい。 |
| 試料のタンパク質が分解されてしまっている |
試料の凍結融解の回数を最小限にして下さい。 |
| 試料を保存する前に，プロテイナーゼ阻害物質を添加して下さい。 |
| 新鮮な試料を用意して下さい。 |
| 試薬がコンタミネーションしている |
各バッファーに微粒子や微生物のコンタミネーションがないことを確認して下さい。新しいバッファーを調製して下さい。 |
| バックグラウンドが高い |
| 考えられる原因 |
アドバイス |
| 一次抗体が非特的結合を起こしている |
モノクローナル抗体やアフィニティ精製された抗体を使用して下さい。 |
| 5％ミルクでブロッキングして下さい。一次抗体の希釈は，ミルク（2～5％）またはNaCl（0.15～0.5M）で調節して下さい。 |
| 抗体濃度を小さくしてみて下さい。 |
| 二次抗体が非特異的結合を起こしている |
二次抗体とコントロールを混合した試料を，ゲルに泳動して下さい。もしバンドが出てしまった場合は，違う二次抗体を使用して下さい。 |
| ブロッキングが不十分である |
5％スキムミルク，0.1～0.5% Tween 20，0.15～0.5M NaCl in 25mM Tris (pH 7.4)のブロッキングバッファーを使用して下さい。インキュベーション時間を長くして下さい。シグナルの出方に応じて，ミルク濃度を上下に調節して下さい。 |
| ブロッキングを4℃でオーバーナイトさせると，界面活性剤が低い温度では効果的でないため，ブロッキング効率を下げる可能性があります。 |
| 目的タンパク質中にスキムミルク成分が含まれてしまっている |
ミルクの代わりに3％BSAに置き換えてみて下さい。 |
| スキムミルクにビオチンが混入してしまっており，アビジン／ストレプトアビジンと使用できない。 |
ミルクの代わりに3％BSAに置き換えてみて下さい。 |
| IgY抗体がミルクタンパク質を認識してしまっている |
ミルクの代わりに3％BSAに置き換えてみて下さい。 |
| 洗浄が不十分である |
洗浄回数を増やしてみて下さい。 |
| メンブレンの洗浄バッファー中のTween 20濃度を上げてみてください（0.1～0.5％）。 |
| 一次抗体が非特的結合を起こしている |
抗体希釈液および洗浄バッファー中のNaCl濃度を，減らしてみて下さい（0.15～0.5M）。 |
| フィルムの露光が過剰 |
露光時間を減らしてみて下さい。 |
| バンドが拡散してしまう |
| 考えられる原因 |
アドバイス |
| ゲル中に泳動させるタンパク質量が過剰 |
ゲルに泳動させるタンパク質量を減らしてみて下さい。 |
| 考えられる原因 |
アドバイス |
| シグナルが過剰に発している |
抗体やタンパク質の濃度を下げてください。 |
| 考えられる原因 |
アドバイス |
| 試薬がコンタミネーションしている |
各バッファーに微粒子や微生物のコンタミネーションがないことを確認して下さい。新しいバッファーを調製して下さい。 |
| インキュベーションや洗浄に使用するバッファー量が不十分 |
メンブレンのインキュベーションや洗浄に，十分量のバッファーを使用して下さい。 |
| メンブレン上に気泡が付いてしまっている |
そっと気泡を除去して下さい。トランスファー時に，メンブレンとゲルの間に気泡が入らないように注意して下さい。 |
| インキュベーション中の振盪が均一になっていない |
ロッカーやシェーカーでアジテーション（振盪 ）が均一になるように調節して下さい。 |
| 機器にコンタミネーションが起きている |
電気泳動槽が十分に洗浄できているか確認して下さい。タンパク質やゲルの欠片が残存していない（メンブレン上がべたついていない）ことを確認して下さい。また洗浄を十分に行ってください。 |
| HRPがアグリゲーションしている |
フィルターでHRP凝集物を除去して下さい。 |
| 露出時間が長すぎる |
露出時間を減らしてみてください。 |
